www.infectology.ru
Новое:  Анизакидоз Актуально: Клещевые инфекции ISSN 1609-9877
  Главная/Новости
Поиск по сайту Поиск на сайте  
Вопросы:: Вы можете задать свой вопрос специалистам в области инфекцинных болезней и паразитологии.
Для всех:
Инфектология для всех
Новые книги
Советы путешественнику
Календарь прививок
Глистные инвазии человека New!
Мифы и легенды
Реестр специалистов
Последние новости: RSS 2.0

22.10.16 В США началась эпидемия венерических инфекций

22.10.16 В Москве количество ВИЧ-инфицированных выросло вдвое

24.10.15 В ВОЗ собираются провести пробные испытания первой вакцины от малярии на детях

28.04.14 Массовая вспышка дизентерии в Новоуткинске.

21.04.14 Обновлены требования по профилактике инфекционных и паразитарных болезней в России

Обучение:
Реклама:
Мультимедиа:
CD "Руководство и атлас по инфекционным и паразитарным болезням человека", 2008 год New!
Найди себе доктора!
Для студентов:
Симптомы и синдромы
Справочники и пособия
Вопросы и ответы
Для специалистов:
Компетентное мнение
Руководящие документы
Справочники и пособия
Статьи и обзоры
Авторефераты
Реестр специалистов
Визитные карточки
Синдромы и симптомы
Микроскоп от А до Я
Новые книги
Конференции
Общества
О "Вестнике..."
Сайты:


Оглавление Лабораторная диагностика паразитарных болезней

Токосплазмоз.

Лабораторная диагностика

Лабораторные методы диагностики токсоплазмоза основаны на паразитологических и иммунологических исследованиях. Паразитологическая диагностика осуществляется методом прямого микроскопирования и методом биопроб.

Для прямого микроскопирования готовят мазки и отпечатки из пунктата или биопсированных частиц лимфатических узлов, миндалин, из центрифугата спинномозговой жидкости и крови, мазки и гистологические срезы из кусочков органов трупов ( головного мозга, печени, селезенки). При патологии беременности исследуются плацента, плодные оболочки и околоплодная жидкость. Просматри-

вать препараты следует тщательно, так как токсоплазм в исследуемом материале бывает мало и их можно спутать с другими простейшими или грибами. В препаратах,окрашенных по Романовскому-Гимзе, токсоплазмы имеют полулунную или аркообразную форму. Один конец их клетки заострен, а другой закруглен. Относительно крупное ядро, как правило, располагается в центре клетки , занимая от 1/4 до 1/3 ее площади. Ядро окрашивается в различные оттенки рубиново-красного цвета, а цитоплазма - в голубые тона. Типичные размеры токсоплазм - 4-7 х 2-4 мкм.(рис.6). Обнаружение в препаратах токсоплазм , расположенных внутри макрофагов или внеклеточно, имеет бесспорное диагностическое значение.

Выделение возбудителя производится методом биопроб, которые чаще всего ставят на белых мышах, так как у них редко встречается спонтанный токсоплазмоз, наблюдающийся у морских свинок, кроликов и других животных. При этом необходимо соблюдать меры предосторожности: работа должна проводиться в настольном боксе или за защитным стеклом, в перчатках и защитной маске. Из взятого стерильно исследуемого материала (обычно при отрицательных результатах микроскопии) готовится взвесь на стерильном физиологическом растворе и вводится мышам, как правило, внутрибрюшинно в дозе до 1 мл.

Кровь у больных с подозрением на токсоплазмоз, берут в количестве 3-4 мл. После оседания эритроцитов плазму отсасывают и центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин. Мышам вводят по 0,5 мл образовавшегося осадка. Спиномозговую жидкость обрабатывают так же как и кровь. К трупному материалу добавляют антибиотики. При наличии в инъецированном субстрате токсоплазм мыши заболевают и у них развивается асцит. На 3-4 день после заражения перитонеальный экссудат отсасывается шприцом в стерильную пробирку. Если его взять не удается, то в брюшную полость вводят 0,5 стерильного физиологического раствора, а затем отсасывают его обратно и переносят в пробирку. На окрашенных по Романовскому-Гимзе препаратах, приготовленных из экссудата, а также из тканей селезенки, печени, легких и других органов мышей, внутри и вне клеток обнаруживаются отдельные токсоплазмы и их скопления . Путем пассажей перитонеального экссудата на мышах можно поддерживать культуру токсоплазм с целью приготовления антигенов для серологических реакций. Материал, взятый для пассажа, желательно использовать немедленно, но допустимо сохранение его в условиях холодильника при 2-40C в течение 1-2 суток.

При заражении маловирулентным штаммом заболевание у мышей клинически не проявляется; перитонеальный эксудат не образуется. В этих случаях за животными ведется наблюдение в течение 10-14 дней (иногда до месяца), а затем, если они не заболевают, проводят еще 3-5 слепых пассажей. Для этого обычно используются ткани головного мозга (иногда селезенки). При каждом пассаже производится контроль пассируемого материала методом прямой микроскопии препаратов. Для их приготовления скальпелем берут с поверхности разреза головного мозга небольшое количество мозгового вещества (желательно из коркового слоя), наносят его на предметное стекло и, накрыв другим стеклом, раздавливают. Окрашивают и просматривают препараты на обоих стеклах. В них можно обнаружить как свободно лежащие токсоплазмы, так и их цисты. При этом токсоплазмы необходимо дифференцировать от морфологически сходных с ними других простейших, нередко встречающихся в органах лабораторных животных (табл.2).

Таблица СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПАРАЗИТОВ,СХОДНЫХ С TOXOPLASMA GONDII (по Тетмору с дополнениями и изменениями Д.Н.Засухина)

Признаки

Toxoplasma gondii

Besnoitia jellisoni

M-организм

Klossiella

Nosema

Размеры одиночных паразитов (микрометры)

5-7х3

7х2

5х2

4х8

2-4х1

Форма паразитов

в виде дольки апельсина

веретеновидная

веретеновидная

грушевидная

овальная

Форма концов паразита

один заострен, другой закруглен

оба заострены

оба заострены

один заострен, другой закруглен

 

Ядро

рыхлое

к о м п а к т н о е

Размеры псевдо цисты (микрометры)

20-100 и более

20-100

50-40

до 60

до 50

Форма псевдоцисты

Круг или овал

о к р у г л а я

Локализация

печень, селезенка, мозг, мышцы

глаз,мышцы и др.

мозг, мышцы

почки и др. органы

мозг, почки

 

Ведущее значение в клинической диагностике токсоплазмоза имеют иммунологические методы исследования: РНИФ,РИФ, ИФА, РСК.

Реакция непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ). Для проведения РНИФ используется коммерческий лиофилизированный антиген (ИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи). Отобранные тонкие предметные стекла без царапин тщательно промывают и обезжиривают в смеси спирта с эфиром. Перед нанесением антигена стекла протирают чистой сухой хлопчатобумажной тканью.

С помощью абразива или лака плоскость стекла делят на десять полей (два ряда по пять полей). У одного края предметного стекла оставляют место для обозначения номера.

На каждое из десяти полей с помощью шприца с тонкой иглой наносят мазки антигена (разведение антигена указано на ампуле), представляющего собой взвесь токсоплазм. Диаметр мазка 3-4 мм. Мазки высушивают при комнатной температуре и хранят до использования при -10-15оС.

Постановка реакции:

1. Предметные стекла с антигеном извлекают из холодильника, подсушивают при комнатной температуре, а затем помещают во влажную камеру на 10-15 мин.

На каждый мазок наносят каплю разведенной исследуемой сыворотки или ликвора. На одном стекле можно разместить и исследовать десять капель разных сывороток или одной сыворотки в десяти разведениях.

2. Препараты помещают во влажную камеру при 37оС на 30 мин.

3. После инкубации их промывают в течение 5-10 мин. в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) pH=7,2. Смыв остатки ФСБ дистиллированной водой, препараты высушивают при комнатной температуре.

4. На мазки наносят стандартную меченую флюоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ) антисыворотку против глобулинов человека (ИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи) в рабочем разведении, указанном на ампуле. Для увеличения контрастности препаратов и снижения неспецифического свечения к флюоресцирующей антисыворотке добавляют стандартный бычий альбумин, меченый родамином (ИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи) в указанном на ампуле разведении.

5. Препараты вновь помещают во влажную камеру при 37оС на 30 мин.

6. Извлеченные из влажной камеры препараты промывают ФСБ pH=7,2, а затем дистиллированной водой так, как это описано в п.3.

7. Подсушенные препараты исследуют под люминисцентным микроскопом. Источником ультрафиолетовых лучей служит ртутная лампа ДРШ-250-3. Используют фильтры возбуждения СС 15-2+ФС 1-4 и запирающие фильтры ЖС 18+ЖЗС 19. Препараты изучают без покровных стекол с применением иммерсионного объектива 90x и бинокулярной насадки с окулярами 5x.

При постановке РНИФ ставят следующие контроли:

а) антиген + меченая антисыворотка

б) антиген + заведомо отрицательная сыворотка + меченая антисыворотка

в) антиген + заведомо положительная сыворотка + меченая антисыворотка

Учет результатов. При отрицательном результате токсоплазмы окрашиваются в красно-бурый цвет. При наличии в исследуемой сыворотке специфических антител наблюдается яркое желто-зеленое свечение по периферии токсоплазм.

За титр антител принимают максимальное разведение сыворотки, при котором еще сохраняется периферическое желто-зеленое свечение большинства токсоплазм в разных полях зрения. При этом светящийся ободок вокруг каждой из них должен быть непрерывным.

Отрицательный результат РНИФ при исследовании сыворотки в минимальных разведениях с большой вероятностью позволяет предположить отсутствие токсоплазмозной инвазии. Наличие ее подтверждается выявлением титра специфических антител 1:20 и выше. Увеличение титра антител в 4 и более раза при исследовании парных сывороток свидетельствует об активном инфекционном процессе.

Иммуноферментный анализ (ИФА).Постановка ИФА осуществляется при помощи коммерческих тест-систем (НИИЭМ им.Пастера; ИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи). В состав набора входят:

- полистироловые планшеты, сенсибилизированные токсоплазменным антигеном (одноразового применения) - 2 шт;

- контрольная отрицательная сыворотка - 0,1 мл, 1 ампула/флакон;

- контрольная положительная сыворотка - 0,1 мл, 1 ампула/флакон;

- антитела против иммуноглобулинов человека, меченые пероксидазой хрена (коньюгат) - 2 ампулы;

- ортофенилендиамин (ОФД) - 5мг, 2 пробирки;

- твин-20 (детергент) - 1 ампула/флакон;

- навеска солей фосфатно-солевого буферного раствора Nо1 (ФСБ) - 1 пакет;

- навеска солей субстратного буферного раствора - 1 пакет.

Приготовление основных растворов для ИФА:

Раствор No1. Навеску солей фосфатно-солевого буферного раствора растворяют в 1 л дистиллированной воды.

Раствор No2. Навеску солей субстратного буферного раствора растворяют в 25 мл дистиллированной воды.

Раствор No3. 0,5 мл твина растворяют в 1 л раствора No1.

Раствор No4. 1 таблетку гидроперита растворяют в 10 мл дистиллированной воды.

Раствор No5. 1 мл концентрированной серной кислоты добавляют к 12 мл дистиллированной воды.

Методика проведения ИФА:

Перед началом работы необходимо убедиться в герметичности ампул. Нельзя использовать в работе ампулы с трещинами, некачественной запайкой.

1. Перед постановкой реакции планшеты отмывают трехкратно по 4-5 мин раствором No3 (буферный раствор вносят по 0,25-0,3 мл).

2. Флаконы с положительной и отрицательной контрольными сыворотками растворяют в 0,1 мл дистиллированной воды. Полученные растворы нативных сывороток можно хранить при температуре +4+2оС в течение 5+2 суток или при температуре -20оС до 2-х недель. Перед постановкой реакции сыворотки разводят в отношении 1:400. Для этого 10 мкл нативной сыворотки растворяют сначала в 200 мкл раствора No3 (получают разведение 1:20), а затем 10 мкл сыворотки этого разведения еще раз растворяют в 200 мкл раствора No3 и таким образом получают разведение 1:400. Растворы хранению не подлежат. Исследуемые сыворотки разводят по такому же принципу. При проведении скрининга все сыворотки, в том числе положительную и отрицательную контрольные сыворотки, вносят в лунки по 0.1 мл в разведении 1:400.

При проведении раститровки сывороток контрольные положительную и отрицательную сыворотки вносят в лунки двух вертикальных рядов планшета по 0,1 мл. В остальные лунки вносят по 0,1 мл исследуемой сыворотки в разведении от 1:400 до 1:51200. Планшеты закрывают крышкой и помещают в термостат на 30 мин. при температуре +37+1оС.

3. Планшеты отмывают четырехкратно, как указано в п.1.

4. Коньюгат разводят в 12 мл раствора No3. Полученное разведение коньюгата 1:20000 добавляют по 0,1 мл в каждую лунку планшета и помещают в термостат на 30+5 мин. при температуре 37+1оС.

Реакцию сопровождают контролем коньюгата: в лунку с антигеном добавляют коньюгат и субстрат. Оптическая плотность (ОП) данного контроля не должна превышать 0,15.

5. Отмывают планшеты 5-6 раз, как указано в п.1.

6. ОФД растворяют в 12 мл раствора No2. Непосредственно перед внесением в лунки к раствору добавляют 0,17 мл раствора No4. Полученную субстратную смесь вносят в лунки по 0,1 мл и помещают на 15 мин. при температуре 20+1оС в темноту. Реакцию останавливают добавлением в лунки по 0,1 мл раствора No5.

Учет результатов:

Результаты реакции учитывают визуально или фотометрически при длине волны 492 нм. При визуальном учете появление желтого окрашивания в лунках с исследуемой сывороткой при отсутствии окрашивания отрицательной контрольной сыворотки свидетельствует о положительной реакции. При фотометрическом учете результат считают положительным, если оптическая плотность исследуемой сыворотки в 2 и более раза превышает значение ОП отрицательной контрольной сыворотки в разведении 1:400, которое не должно превышать значение 0,2; при этом ОП положительной сыворотки должно быть значительно выше 0,2. Среднее значение ОП при контроле коньюгата не должно превышать 0,2. При положительных результатах исследуемых сывороток в разведении 1:400 проводят их дальнейшее титрование путем последовательных двукратных разведений. Положительным результатом считают то разведение сыворотки, ОП которой в 2 и более раза превышает ОП контрольной отрицательной сыворотки в соответствующем разведении, при этом ОП положительной сыворотки должна быть существенно больше 0,2. При визуальном учете исследуемую сыворотку (ее разведение ) расценивают как положительно реагирующую, если наблюдается достаточно интенсивное окрашивание, заметно превосходящее окрашивание в лунках с отрицательной контрольной сывороткой.

Положительный результат однократного исследования любым из перечисленных методов свидетельствует лишь о том, что обследуемый пациент был инвазирован токсоплазмами. Для суждения о давности заражения и активности процесса небходимо проводить исследования парных сывороток,полученных через 2-3 недели, одновременно с помощью нескольких серологических реакций. Четырехкратное и более нарастание титров специфических антител, выявляемое несколькими серологическими реакциями, указывает на активность инфекционного процесса, а присутствие специфических IgM-антител - на недавнее первичное заражение. При определении IgM-антител с помощью стандартных вариантов методик РИФ и ИФА возможна регистрация ложноположительных результатов реакций, обусловленных присутствием в крови ревматоидного фактора. На фоне высокого содержания IgG-специфических антител обе указанные реакции могут давать ложноотрицательные результаты.


© Коллектив авторов, 1998-2013, Почтовый адрес: 195009, Санкт-Петербург, а/я 16


 

Высококачественный доступ в Интернет предоставлен ГНУ "Вузтелекомцентр" и его структурным подразделением UniTel.

  ВНИМАНИЕ:  Информация, представленная на данном сайте, не должна использоваться для самостоятельной диагностики и лечения, и не может служить заменой очной консультации врача!