www.infectology.ru
Новое:  Анизакидоз Актуально: Клещевые инфекции ISSN 1609-9877
  Главная/Новости
Поиск по сайту Поиск на сайте  
Вопросы:: Вы можете задать свой вопрос специалистам в области инфекцинных болезней и паразитологии.
Для всех:
Инфектология для всех
Новые книги
Советы путешественнику
Календарь прививок
Глистные инвазии человека New!
Мифы и легенды
Реестр специалистов
Последние новости: RSS 2.0

22.10.16 В США началась эпидемия венерических инфекций

22.10.16 В Москве количество ВИЧ-инфицированных выросло вдвое

24.10.15 В ВОЗ собираются провести пробные испытания первой вакцины от малярии на детях

28.04.14 Массовая вспышка дизентерии в Новоуткинске.

21.04.14 Обновлены требования по профилактике инфекционных и паразитарных болезней в России

Обучение:
Реклама:
Мультимедиа:
CD "Руководство и атлас по инфекционным и паразитарным болезням человека", 2008 год New!
Найди себе доктора!
Для студентов:
Симптомы и синдромы
Справочники и пособия
Вопросы и ответы
Для специалистов:
Компетентное мнение
Руководящие документы
Справочники и пособия
Статьи и обзоры
Авторефераты
Реестр специалистов
Визитные карточки
Синдромы и симптомы
Микроскоп от А до Я
Новые книги
Конференции
Общества
О "Вестнике..."
Сайты:

Купить суперконцентраты полимерных красителей и добавки для полимеров
proftehnastil.ru
Увлажнители и очистители воздуха
moshoztorg.ru

Назад

Хламидиоз. Методические рекомендации. Диагностика хламидий методом ПЦР

В настоящее время полимеразная цепная реакция (ПЦР) является наиболее распространенной и объективной методикой диагностики хламидийной инфекции.

Клинический материал для ПЦР собирают в пробирки с буферным раствором. Хранят в морозильных камерах. Повторное замораживание - оттаивание не допускается. Обработка материала:

Клинический материал в объеме 100 мкл смешивают с 100 мкл лизирующего буфера (1% твин-20, l% NP-40, 60 мкг/мл протеиназы К, фосфатный буфер) Смесь инкубируют при 56о С в течение 2 часов, после чего инактивируют при 95оС в течение 10 мин. Термическая обработка необходима для инактивации протеиназы К и обеззараживания клинического образца. Инактивированные образцы центрифугируют при 10000 д 10 мин. Супернатант собирают и используют для проведения ПЦР.

Проведение ПЦР:

Реагенты вносят в реакционную пробирку в следующей последовательности:

- вода бидистиллированная - до 30 мкл конечного объема смеси;

- реакционный буфер 10х-2,5 мкл:

- 650 мМ раствор МдСl2 - 1,2 мкл;

- смесь dNTP's - 2,5 мкл;

- Taq полимераза -1-1,5 ед.;

- олигонуклеотидные праймеры - 15 нмоль;

- контрольный образец ДНК или клинический образец - 1-2 мкл.

Для предохранения от испарения поверх реакционной смеси наслаивают 30 мкл минерального масла. Пробирки помещают в амплификатор.

Проводят ПЦР в следующих температурных режимах:

96°С 4 мин, 55°С 10 мин - 1 цикл;

95°С 1 мин, 55°С 1 мин, 72°С 2 мин - 35 циклов;

После завершения ПЦР продукты амплификации фракционируют методом электрофореза в 1,5% агарозном геле. Наличие специфического фрагмента ДНК определяют с помощью контрольной ДНК исследуемого возбудителя, амплифицированной одновременно с клиническими образцами.

Результат анализа считается положительным в следующем случае:

- размер ДНК-продукта в клиническом образце точно соответствует ДНК-продукту положительной контрольной пробы;

- в пробе, содержащей клинический образец и внутренний стандарт идентифицируют специфический ДНК-продукт внутреннего стандарта;

- в пробе, содержащей вместо клинического образца аликвоту воды (отрицательный контроль), ДНК-продукты не обнаруживают.

Результат анализа считается отрицательным в следующем случае:

- в пробе, содержащей клинический образец, специфических ДНК-продуктов не обнаруживают;

- результаты ПЦР в обеих контрольных пробах - как в предыдущем случае. Анализ следует повторить в следующих случаях:

- в пробе, содержащей контрольную ДНК, специфический продукт не обнаруживают;

- в пробе с внутренним стандартом специфический продукт не обнаруживают;

- в отрицательном контроле обнаруживают специфический ДНК-продукт.

Описанные выше три методики лабораторной диагностики хламидиоза в настоящее время являются наиболее точными и информативными.

Мы не будем в настоящей работе описывать промышленные тест-системы, основанные на прямой и непрямой иммунофлюоресценции, ибо каждая из них содержит соответствующую инструкцию. Стоит лишь сказать, что все они имеют несколько меньшую точность, но существенно выигрывают в простоте постановки диагноза.

Исключить артефакты, возникающие при диагностике хламидиоза люминесцентными методами, позволяет дополнительный тест, предложенный профессором В.В. Делекторским. Тест основан на том, что элементарное тельце хламидий (инфекционная единица) представляет собой кристаллоид, что является следствием макромолекулярной упаковки ДНК. Перефокусировка люминесцентного микроскопа приводит к возникновению по периферии элементарного тельца четкого дифракционного кольца (кольца Френеля).

Другие микроорганизмы, а также ретикулярное тельце хламидий, дифракционное кольцо не образуют. Достоверность метода не требует находки 10 элементарных телец в микроскопе.

Диагноз считается положительным, если в препарате обнаруживают 2-3 элементарных тельца, образующих при фокусировке дифракционные кольца. Наличие дифракционного кольца у исследуемых структур является дополнительным диагностическим тестом, позволяющим исключить ошибки.

Следует особенно отметить, что при наличии смешанного процесса, в частности гонорейно - хламидийного, диагностика хламидиоза иммунофлюоресцентными методами затруднена. Это связано с тем, что при гонорее за счет большого количества лейкоцитов слизистые покрыты слоем белка, следствием чего является большое количество ложноотрицательных результатов. Инкубационный период при гонорейной и хламидийной инфекции различен, поэтому при одновременном инфицировании этими двумя микроорганизмами, хламидий могут выявляться значительно позже.


© Коллектив авторов, 1998-2013, Почтовый адрес: 195009, Санкт-Петербург, а/я 16


 

Высококачественный доступ в Интернет предоставлен ГНУ "Вузтелекомцентр" и его структурным подразделением UniTel.

  ВНИМАНИЕ:  Информация, представленная на данном сайте, не должна использоваться для самостоятельной диагностики и лечения, и не может служить заменой очной консультации врача!