www.infectology.ru
Новое:  Анизакидоз Актуально: Клещевые инфекции ISSN 1609-9877
  Главная/Новости
Поиск по сайту Поиск на сайте  
Вопросы:: Вы можете задать свой вопрос специалистам в области инфекцинных болезней и паразитологии.
Для всех:
Инфектология для всех
Новые книги
Советы путешественнику
Календарь прививок
Глистные инвазии человека New!
Мифы и легенды
Реестр специалистов
Последние новости: RSS 2.0

22.10.16 В США началась эпидемия венерических инфекций

22.10.16 В Москве количество ВИЧ-инфицированных выросло вдвое

24.10.15 В ВОЗ собираются провести пробные испытания первой вакцины от малярии на детях

28.04.14 Массовая вспышка дизентерии в Новоуткинске.

21.04.14 Обновлены требования по профилактике инфекционных и паразитарных болезней в России

Обучение:
Реклама:
Мультимедиа:
CD "Руководство и атлас по инфекционным и паразитарным болезням человека", 2008 год New!
Найди себе доктора!
Для студентов:
Симптомы и синдромы
Справочники и пособия
Вопросы и ответы
Для специалистов:
Компетентное мнение
Руководящие документы
Справочники и пособия
Статьи и обзоры
Авторефераты
Реестр специалистов
Визитные карточки
Синдромы и симптомы
Микроскоп от А до Я
Новые книги
Конференции
Общества
О "Вестнике..."
Сайты:

Источник: http://bilsh.com/
Гомеопатические капли, мази, сиропы и пр
farm-west.ru
Бухгалтерская система. Справочная служба
poschitaem.ru

Назад

Хламидиоз. Методические рекомендации. Диагностика хламидий методом гибридизации ДНК

Для определения ДНК хламидий часто используют весьма информативный метод точечной гибридизации (дот гибридизации) нуклеиновых кислот на твердой фазе с использованием ДНК-зонда, меченного биотином. Из исследуемых образцов выделяют суммарную ДНК. Образцы исследуемой ДНК и контрольные образцы денатурируют кипячением, фиксируют на нитроцеллюлозном фильтре и гибридизуют с предварительно денатурированным биотинированным ДНК-зондом. Не связавшийся зонд удаляют путем отмывки фильтра. На следующем этапе фильтр обрабатывают коньюгатом страптавидина с щелочной фосфатазой. На заключительном этапе вносят субстратный раствор. Окрашивание соответствующих точек свидетельствует о наличии тестируемой ДНК в исследуемом материале.

Рабочие растворы готовят согласно инструкции предприятия изготовителя тест-системы. Гинекологические мазки переводят в физиологический раствор и центрифугируют при 3000 об/мин 10 мин., надосадочную жидкость сливают, а оставшуюся суспензию клеток хранят в замороженном виде до проведения анализа.

Проведение анализа:

В чашку Петри с 10-15 мл дистиллированной воды помещают нитроцеллюлозный фильтр на 5-10 мин до полного смачивания. Мокрый фильтр переносят в другую чашку с 4 мл раствора 10xSSC. выдерживают 10 минут и подсушивают на воздухе на фильтровальной бумаге

100 мкл суспензии клеток анализируемого материала смешивают с равным объемом лизирующего раствора, тщательно перемешивают и выдерживают 3 часа при 37-40°С и 5 мин при 60°С. Затем добавляют 0,05 мл ацетата калия, перемешивают и выдерживают 30 мин при 0 - 4°С, после чего центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость сливают, осадок перемешивают на воздухе и растворяют в 10 мкл раствора 10xSSC Подготовительные пробы, положительный и отрицательный контроли денатурируют на кипящей водяной бане и течение 10 мин, затем быстро переносят пробирки в баню лед-вода на 5 мин и наносят па подготовленный фильтр по 2 мкл в пятно, фильтр высушивают на воздухе и запекают при 80°С в течение 2 часов.

Далее фильтр с пробами смачивают в дистиллированной воде, переносят в чашку Петри и заливают сверху 10 мл блокирующего раствора. Фильтр инкубируют 1 час при комнатной температуре на качалке, затем блокирующий раствор сливают и фильтр заливают 5 мл гибридизационного раствора. При этом необходимо тщательно закрыть чашку Петри для избежания испарения гибридизационного раствора. Гибридизацию проводят при 42о С в течение 12-15 ч в термостате. Фильтр отмывают от несвязавшегося зонда путем трехкратной инкубации при комнатной температуре по 10 мин в промывочном растворе. Далее фильтр инкубируют 15 мин в водяной бане при температуре 60о С в промывочном растворе и один раз в течение 5 мин при комнатной температуре в растворе TST.

Для блокирования неспецифического связывания коньюгата фильтр заливают 10 мл раствора для блокирования и выдерживают 0,5 ч при комнатной температуре на шейкере. Далее фильтр ополаскивают раствором TST и выдерживают в 6 мл рабочего раствора коньюгата в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем фильтр 3 раза по 10 мин промывают в растворе TST и один раз в растворе для приготовления проявляющей смеси. Фильтр заливают 5 мл проявляющей смеси с субстратом и хромогеном и и выдерживают в темноте при 20о С в течение нескольких часов до появления окраски. Фильтр промывают дистиллированной водой для остановки проявления и высушивают.

Учет результатов:

Результаты гибридизации оценивают визуально путем сравнения с интенсивностью окраски пятен контрольных проб. Положительными считаются образцы, имеющие окраску пятна, отчетливо отличающуюся вследствие большей интенсивности от фоновой окраски.


© Коллектив авторов, 1998-2013, Почтовый адрес: 195009, Санкт-Петербург, а/я 16


 

Высококачественный доступ в Интернет предоставлен ГНУ "Вузтелекомцентр" и его структурным подразделением UniTel.

  ВНИМАНИЕ:  Информация, представленная на данном сайте, не должна использоваться для самостоятельной диагностики и лечения, и не может служить заменой очной консультации врача!