Этиология.
Таксономическая классификациявозбудителей Лайм-боррелиоза.
Возбудители ЛБ относятся к порядку Spirochaetales, семейству Spirochaetaceae,
роду Borrelia. Свое родовое название они получили в честь французского
микробиолога A.Borrel, изучавшего в начале ХХ века эту разновидность спирохет.
Все известные виды рода Borrelia морфологически весьма сходны. Это
грам-отрицательные спирохеты, длиной от 10 до 30 мкм и шириной 0,20-0,25 мкм,
их размеры могут изменяться в разных хозяевах и при культивировании. По форме
представляет собой извитую, лево- или правовращающуюся спираль. Многие боррелии
являются причиной инфекционных заболеваний человека, например, возвратных
лихорадок - B.recurrentis, B.duttoni, B.hermsii и др. Одна из боррелий,
Borrelia burgdorferi, названа в честь Willy Burgdorfer, который вместе с Alan
Barbour в 1982 году выделил культуру этих микроорганизмов от пациента с
болезнью Лайма. Дальнейшее изучение многих изолятов боррелий, полученных из
переносчиков и от больных в различных точках нозоареала этой инфекции показало,
что в группе боррелий, относящихся к одному виду, имеются существенные
внутривидовые отличия
В настоящее время по отличиям в нуклеотидных последовательностях ДНК различают
10 геновидов боррелий. Все они составляют комплекс B.burgdorferi senu lato,
представители которого неравномерно распределены в пределах нозоареала этой
инфекции. Кроме того, не все боррелии данного комплекса являются патогенными
для человека. В Европе доказана патогенность 3 геновидов: B.burgdorferi sensu
stricto, B.garinii и B.afzelii. Распространенность этих геновидов в различных
географических регионах мира также различна, как и других представителей
комплекса B.burgdorferi s.l. Длительное время считалось, что в природных очагах
на территории России B.burgdorferi s.s. отсутствует, а соответственно и нет
больных, у которых этиологическим агентом заболевания выступает этот геновид
боррелий. В 1998 году B.burgdorferi s.s. была обнаружена в иксодовых клещах на
территории России, а в 1999 году доказана этиологическая роль этого возбудителя
у некоторых больных в Северо-Западном регионе России (Лобзин Ю.В. и соавт.,
1999).
Даже у одного и того же геновида боррелий наблюдается вариабельность в составе
поверхностных белков, особенно OspA и OspC. Наибольшая их гетерогенность
обнаруживается у B.garinii (по OspC - 13 вариантов, по OspA - 7) и B.afzelii
(по OspC - 8, по OspA - 2). B.burgdorferi s.s. отличается относительным
постоянством спектра поверхностных белков, причем наиболее консервативны в этом
отношении северо-американские штаммы.
Морфология возбудителей Лайм-боррелиоза.
При темнопольной или фазово-контрастной микроскопии хорошо определяется
спиралевидная форма боррелий, которая характеризуется своей непостоянностью.
При витальном наблюдении видны их медленные вращательные движения. Длина
микроорганизма (10-30 мкм) значительно превышает поперечный размер (0,20-0,25
мкм). При электронной микроскопии можно различить структурные элементы
боррелии: 1. На поверхности находится толстый аморфный мукоидный слой, имеющий
название "S-слой"; 2. Цитоплазматическая мембрана. 3.
Периплазматическое пространство. 4. Эндофлагеллярный комплекс. 5.
Протоплазматический цилиндр.
S-слой у боррелии крайне неустойчив и очень легко отделяется от внешней мембраны
и часто отсутствует. Наличие мукоидного слоя иногда является помехой для
электронной микроскопии вследствие его интенсивного прокрашивания и затенения
структурных элементов микробной клетки.
Следующий структурный элемент - очень гибкая билипидная цитоплазматическая
мембрана, между слоями которой располагается эндофлагеллярный комплекс,
змеевидно переплетающий протоплазматический цилиндр по длине микроорганизма и
обусловливающий его поступательное движение при сокращении нитей. Каждый
эндофлагеллярный комплекс состоит из флагеллярных нитей, флагеллярного крючка и
основного диска. Сокращение нитей, сцепленных между собой и прикрепленных к
концам микробной клетки, а также их спиралевидное расположение по всей длине,
обеспечивают вращательные движения боррелий.
Количество эндофлагелл у различных изолятов боррелий вариабельно. Их число во
многом зависит от физиологического состояния бактериальной клетки и условий
культивирования (pH среды, питательных добавок и т.п.).
Протоплазматический цилиндр находится за внутренним слоем цитоплазматической
мембраны и содержит нуклеоид, рибосомы, ДНК-ассоциированные молекулы и другие
клеточные структурные элементы.
Иногда на поверхности боррелий заметны выпячивания, которые могут быть двух
типов.
1.Выпячивания внешнего слоя цитоплазматической мембраны часто формируются ближе
к концевым участкам спирохеты, по ее боковым поверхностям. Данные изменения
характерны для "умирающих" клеток. Подобные выпячивания часто
наблюдаются у культуры боррелий in vitro в результате длительной их инкубации.
2. Второй тип выпячиваний, в виде сферических выпуклостей, формируется на концах
боррелий. Они образованы собственно цитоплазматической мембраной и
протоплазмой, в которой обнаруживается плазмидная ДНК, что позволяет
предполагать их определенную роль в передаче генетического материала.
Патогенетическое значение этих выпячиваний для организма человека до конца не
ясно.
Молекулярная биология возбудителей.
Боррелии in vitro культивируются только в среде обогащенной аминокислотами,
витаминами, альбумином бычьей и кроличьей плазмы и другими веществами
(модифицированная среда BSK - Barbour, Stoenner, Kelli). При температуре +33оС
в анаэробных условиях такая среда может обеспечить рост культуры из 1-2
боррелий. Время генерации боррелий составляет 7-20 часов. По достижении числа
микробных клеток в культуре 106 - 108 в мл возможно осуществление дальнейших
лабораторных исследований. Культура должна пересеваться на питательную среду с
периодом 2-5 недель.
Одной из отличительных особенностей боррелий является то, что они имеют одну
линейную хромосому и, кроме того, еще до 20 кольцевых и линейных плазмид,
известных под названием - микрохромосомы.
К концу 1997 года была установлена полная нуклеотидная последовательность генома
хромосомы, а также девяти линейных и двух кольцевых плазмид эталонного штамма
В31 (B.burgdorferi s.s.). На хромосоме находятся 853 гена, состоящие из 910725
нуклеотидных пар, которые обеспечивают до 29% реализации основных функций
клетки:
-
репликацию, транскрипцию и трансляцию;
-
систему репарации и рекомбинации;
-
транспорт и метаболизм клетки;
-
подвижность и хемотаксис;
-
регуляцию экспрессии генов.
Отсутствие у боррелий генов кодирования синтеза аминокислот, жирных кислот,
ко-факторов и нуклеотидов объясняет столь высокие требования к условиям их
культивирования с использованием сывороточных добавок. Кроме того, поскольку
боррелии хемоорганотрофные анаэробы, то они должны получать энергию для синтеза
АТФ от субстрата фосфорилирования, который имеется только в цитоплазме других
клеток, т.к. у боррелий нет генов, которые кодируют дыхательную цепь
фосфорилирования. Пируват, являющийся одним из наиболее важных промежуточных
звеньев в метаболизме и позволяющий клетке использовать энергию для анаболизма,
вероятно, образуется из глюкозы в процессе гликолиза. Боррелии также испытывают
недостаток других ферментов, необходимых для цикла трикарбоновых кислот и
фосфорилирования. Таким образом, способность их собственных компонентов
метаболизма настолько ограничена, что для своего существования они должны иметь
организм хозяина, который гарантирует поставку готовых питательных веществ.
Иными словами у боррелий наблюдается достаточно четко выраженный феномен
паразитизма.
Экстрахромосомное (плазмидное) генное кодирование не является исключительным
свойством боррелий. Подобное наблюдается и у некоторых других представителей
прокариот. Однако тот факт, что боррелии могут иметь довольно большое
количество линейных и кольцевых плазмид выделяет их среди других
микроорганизмов. Следует заметить, что даже отдельные изоляты одного и того же
геновида боррелий имеют выраженные отличия в плазмидах по их количеству (от 5
до 20) и размеру (от 9 до 70 kb). Особенностью боррелий является также и то,
что плазмиды обнаруживаются преимущественно при первичной изоляции штаммов в
культуре. Последующие пересевы приводят к уменьшению их числа и даже полной
потере, в связи с чем, изменяется и антигенный профиль возбудителя вплоть до
полной утраты инвазионности. Это обстоятельство позволяет предполагать, что
именно в плазмидах содержится информация о специфических белках (антигенах)
которые обусловливают патогенность микроорганизма.
Только 16% из числа расшифрованных нуклеотидных последовательностей ДНК
хромосомы и плазмид эталонного штамма В31 (B.burgdorferi s.s.) могут быть
соотнесены с известными белками боррелий, которые включают:
-
различные липопротеиды (OspA-D);
-
порин;
-
decorin-связывающие белки;
-
ферменты для синтеза порина;
-
различные антигены.
Многие мембранные липопротеины боррелий являются иммуногенами, а значит имеют
большое значение в формировании иммунного ответа со стороны организма хозяина.
Циркуляция возбудителей в природном очаге сопровождается динамическими
изменениями в системе микроорганизм-макроорганизм-окружающая среда. Исходя из
этого боррелии должны обладать такими механизмами адаптации, которые бы
позволяли им в очень короткое время приспособиться к биохимическим особенностям
нового хозяина и обеспечить возможность существования их как вида. Во многом
эти механизмы связаны с динамическими изменениями на уровне функционирования
генома (регуляция экспрессии генов) микроорганизма, проявляющимися
трансформацией состава поверхностных белков боррелий при нахождении их в
различных хозяевах, что в конечном итоге приводит к существенному видоизменению
их антигенного профиля. Таким образом, состав поверхностных белков у боррелий
динамичен и во многом определяется пространственно-временными условиями их
существования.
Изучение белкового состава боррелий с помощью электрофореза позволило
идентифицировать у них более 30 белков, отличающихся разной электрофоретической
подвижностью, т.е. молекулярной массой. Белковый спектр боррелий весьма
вариабелен и различен не только у боррелий разных геновидов, но и среди
изолятов одного геновида. Однако, следует заметить, что вне зависимости от
видовой принадлежности боррелии имеют два главных белковых компонента с
молекулярным весом - 41 кДа (p41 или флагеллин) и 60 кДа (HSP60). Флагеллин
имеет отдельные специфические участки характерные для определенных видов
боррелий. Белок HSP60 не является специфичным и присутствует у многих видов
бактерий.
У боррелий наиболее полно изучены механизмы температурно-зависимой регуляции
экспрессии генов несущих информацию о двух белках внешней мембраны - OspA и
OspC. При нахождении микроорганизма в клеще (температура ниже +24оС), гены,
ответственные за синтез поверхностных белков находятся в разной степени
активности. Это находит свое отражение в белковом составе внешней мембраны
клетки, где всегда присутствует OspA, а белок OspC встречается крайне редко.
Повышение температуры окружающей среды или попадание боррелий в организм
теплокровного животного приводит к активации гена ответственного за синтез OspC
и белок обнаруживается на мембране боррелий. В отношении OspА наблюдается
обратная зависимость. Этим объясняется слабый иммунный ответ организма человека
на OspA, и выраженный - на мембранный белок OspC. Некоторые другие белки (EppA)
обнаруживаются только при нахождении боррелий в организме человека, а в
культуре боррелий они отсутствуют. Столь яркая поверхностно-белковая
изменчивость микроорганизма может быть обусловлена как недостатком некоторых
органических веществ в условиях "обедненной питательной среды", так и
результатом взаимодействия боррелий с эндотелиальными клетками или влияниями
факторов системы комплемента.
Белковый профиль североамериканских штаммов B.burgdorferi s.s. отличается
однородностью по OspA и OspC (последний обнаруживается у них значительно реже),
а OspB более вариабилен. Таким образом, два мембранных белка OspA и OspC
рассматриваются многими исследователями как основные кандидаты для создания
рекомбинантной противоборрелиозной вакцины.
В настоящее время установлены и достаточно хорошо изучены некоторые другие
мембранные антигены боррелий: p83/100, Oms66 (p66), BmpA (p39), HSP60 (p60),
p18, OspD, OspE, OspF. Генетическая информация большинства из них находится в
плазмидах, поэтому, потеря отдельных плазмид, например при длительной
персистенции боррелий в организме человека, обязательно влечет за собой и
изменение структуры поверхностных антигенов, а значит и иммунного ответа.
<< назад | далее
>>
|